現象：標準曲線正常，但所有植物樣品OD都很低，接近空白，算出來蛋白含量遠低于文獻預期。

1、研磨不充分（最常見）

原因：植物纖維多，液氮研磨沒磨成細粉末，組織還是小顆粒，蛋白釋放不wan全。

• ?錯誤：只搗幾下，組織呈碎塊；液氮揮發完才研磨。

• ?解決：
1）樣品加液氮，充分磨成細膩白色粉末，看不到小組織碎片；
2）磨好后，在液氮還沒wan全揮發前快速加預冷提取液；
3）老葉、木質化根要增加研磨時間；可以加少量石英砂助磨。

2、蛋白降解

原因：取樣、研磨、提取過程溫度太高，內源蛋白酶水解蛋白。

• 風險點：室溫操作；研磨完回溫慢；離心溫度不是4℃；樣品放置很久才測。

• ?解決：
1）全部提取步驟冰上/4 ℃操作；
2）提取緩沖液可以加蛋白酶抑制劑PMSF（現加，終濃度1?mM）；
3）離心完上清盡快測，不要放室溫，暫存放?20℃；反復凍融要避免。
β?巰基乙醇主要抗氧化，不能抑制蛋白酶，只加它擋不住降解。
3、提取緩沖液pH不對

Bradford染料結合蛋白對pH敏感；植物蛋白大多中性偏酸，pH偏離7.0?7.4會降低提取效率、降低顯色。

• ?問題：PBS配錯pH；緩沖液久放pH漂移。

• ?解決：
1）校準pH計，提取緩沖液嚴格調到 pH 7.2左右；
2）不要用純水代替緩沖液提取，純水蛋白溶出很差。
注意：高濃度Tris也會干擾Bradford顯色，盡量用PBS體系。
4、樣品量太少

• 情況：取樣鮮重過小；或者提取液加太多，稀釋倍數過大。
舉例：0.1?g葉片，加5?mL提取液，蛋白被過度稀釋，OD壓到接近空白。

• ?調整：
葉片推薦：0.2?0.5 g鮮重 + 1?3 mL提取緩沖液（1:5 ~1:10 w/v）；
如果材料珍貴不能多加樣，減少提取液體積，提高蛋白終濃度。

額外容易忽略2個隱性原因（也會造成OD低）

1. PVP加太多：高濃度PVP會輕微干擾Bradford顯色，PVP?40建議1%即可，不要盲目加高。

2. 取樣部位問題：衰老葉片、木質化老根本身可溶性蛋白本底就很低，不是操作問題，屬于材料本身。